第六節(jié)食源性病原微生物致病機理1、食源性致病菌與食源性疾病2、細菌的致病性和毒力3、宿主的防御機理4、Stepsinsuccessfulinfection,5.Ⅲ型分泌系統(tǒng)(TypeⅢsecretionsystem,T3SS)細菌的分泌系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)是近年為細菌致病機制研究的重要進展，其中的Ⅲ型分泌系統(tǒng)與動植物的許多革蘭氏陰性病原菌的毒力因子的分泌有關。在病原菌與宿主細胞接觸后，這一系統(tǒng)得以啟動，具有接觸介導的特征。啟動后細菌分泌與毒力有關的多種蛋白質，與相應的伴侶蛋白結合，從細菌的胞漿直接進入宿主細胞胞漿，發(fā)揮毒性作用。,幾個細菌的毒力島及其特征,Ⅲ型分泌系統(tǒng)的組成與分泌機制Ⅲ型分泌系統(tǒng)的組成通常由30～40kbp大小的基因組編碼，以毒力島的形式存在于細菌的大質?；蛉旧w。有許多高度保守的主要結構成分，有20種以上的蛋白質組成，在分泌中不同蛋白質發(fā)揮各自的功能型系統(tǒng)。Ⅲ型分泌系統(tǒng)的分泌機制是一次性分泌，是信號肽不依賴型的?？煞置趲追N效應蛋白，蛋白質直接從胞漿送達細胞表面。該系統(tǒng)通常在與宿主細胞接觸后啟動，且分泌產(chǎn)物能夠注入細胞，從而影響宿主細胞信號活動，以利于細菌的入侵。,Ⅲ型分泌系統(tǒng)與細菌致病性的關系其關鍵作用是通過接觸依賴性轉運將底物蛋白轉運到真核細胞內。缺失了該系統(tǒng)的鼠傷寒沙門菌，不論感染途徑如何，都不引起全身性疾病。,Ⅲ型分泌系統(tǒng)的特點是一種多成分分泌系統(tǒng)，在G-細菌中高度保守。關鍵作用是通過接觸依依賴性轉運將底物蛋白轉運到真核細胞內。其分泌的蛋白質不具有典型的分泌蛋白分泌依賴的sec模式。分泌需要輔助蛋白。分泌蛋白質通過細菌內外兩層膜轉運到真核細胞內。能夠把效應分子直接從胞質輸送到細胞表面。溫度，鹽分等環(huán)境因素，可誘導分泌裝置和效應分子的合成。許多編碼該系統(tǒng)的基因與細菌鞭毛裝置基因有一定的同源性。編碼該系統(tǒng)的基因通常聚在一起DNA片段較大。,ProteindeliveryintoeukaryoticcellsbytypeIIIsecretionmachines.Vol444,2006,Nature,TypeIIIsecretionmachines與真核宿主長期共存的細菌已經(jīng)進化形成了特殊的適應能力，從而在這種環(huán)境中生存和復制。這些適應中最明顯的就是III型分泌系統(tǒng)--一種特別進化形成的可將細菌蛋白輸入真核細胞的細胞器官。盡管最早是在少數(shù)病原菌中被發(fā)現(xiàn)，實際上T3SSs可被許多細菌編碼。不僅是細胞器官的組裝和蛋白的分泌，而且還存在合作關系，且與致病機理有關。,Theassemblyofaprotein-deliverymachine針狀組合體由20多種蛋白組成，是迄今發(fā)現(xiàn)的最復雜的細菌蛋白分泌系統(tǒng)。該組合體最早在鼠傷寒沙門菌中發(fā)現(xiàn)，后來在多種其他細菌中檢測到，被認為是所有T3SSs的核心成分。,針狀組合體組裝過程模型discretesteps不連續(xù)的步驟,Multiplesignalstoensuresubstratespecificity轉位酶,革蘭氏陰性菌蛋白分泌系統(tǒng)T1SS分泌系統(tǒng)，又稱ABC分泌系統(tǒng)由位于內膜的提供蛋白質分泌能量的ABC轉位酶、定位在內膜跨過周質的膜融合蛋白(MFP)和外膜蛋白(OMP)等3種功能蛋白組成。大腸桿菌A-溶血素分泌系統(tǒng)該系統(tǒng)所分泌的蛋白直接從胞質到達細菌表面,僅有HlyB、HlyD、TolC三種蛋白參與。其中HlyB、HlyD是位于內膜上的特異組成成分,TolC是位于外膜上形成通用孔道的多系統(tǒng)通用成分。,T2SS廣泛存在于G-菌中,向細胞外分泌各種蛋白，包括胞外酶、蛋白酶、毒素和毒性因子，這些胞外蛋白毒性因子通常破壞寄主細胞，引起組織壞死和病害。分泌元件主要包括:一系列的內膜蛋白(SecD、SecF和SecY),一個為跨膜提供能量的胞內附膜蛋白ATPase(SecA),一個和分泌蛋白相結合的分子伴侶(SecB),以及周質中的信號肽切除酶。,T4SS是接觸依賴性分泌系統(tǒng)，該系統(tǒng)轉運的都是一些大分子物質,如核蛋白顆粒、含多個亞單位的毒素等。該分泌系統(tǒng)是一種自主運輸系統(tǒng)，其分泌的蛋白需切割、加工，而后形成一個孔道使自身穿出外膜。,T5SS系統(tǒng)所分泌的蛋白質首先通過Sec依賴的分泌通路跨內膜轉運，到達外周質間隙后，通過自身C端β結構域在外膜上形成一個β折疊桶，從而實現(xiàn)跨外膜轉運。原蛋白可以從β折疊桶結構域上切割下來或者仍與其相連。自主轉運蛋白系統(tǒng),第七節(jié)食源性微生物風險評估,我國食品安全風險評估現(xiàn)狀2009-12-8成立第一屆國家食品安全風險評估專家委員會食品安全風險評估管理規(guī)定（試行）2010-1-212010-4-22北京，“2010年國際食品安全論壇”，衛(wèi)生部食品安全綜合協(xié)調與衛(wèi)生監(jiān)督局局長蘇志：中國擬建食品安全風險評估中心。,風險評估風險評估是WTO和CAC(國際食品法典委員會)強調的用于制定食品安全控制措施的必要技術手段，是政府制定食品安全法規(guī)、標準和政策的主要基礎，也是實施危險管理措施(如HACCP)的主要依據(jù)。WTO的動植物檢疫協(xié)議(SPS協(xié)議)規(guī)定在確定各國適當?shù)男l(wèi)生和植物衛(wèi)生措施的保護水平時應以危險性評估的結果為主要依據(jù)，即必須在風險評估的基礎上，制定食品中污染物的限量標準。,食源性微生物安全管理制度TheInternationalCommissiononMicrobiologicalSpecificationsforFoods,ICMSF,微生物風險評估的原理風險評估是食品風險分析(包括風險評估、風險管理和風險信息交流)的基礎和核心。四個階段:危害識別：定性方法危害描述：定性/定量方法暴露評估：定性/定量方法風險描述：定性/定量方法英國型或一體型，法國型或分離型,微生物風險評估的評估方法定性風險評估根據(jù)風險的大小，人為地將風險分為低風險、中風險、高風險等類別，以衡量危害對人類影響的大小。定量風險評估對風險的性質和嚴重程度的評估，根據(jù)危害的毒理學特征或感染性、中毒性作用特征，結合其它相關資料，確定污染物(或危害物)的攝入量及其對人體產(chǎn)生不良作用的概率，并對它們之間的關系進行數(shù)學描述。預測微生物學和數(shù)學模型,風險評估的關鍵在于收集充分的高質量可用信息(如因攝入被污染食品引發(fā)疾病的真實資料、數(shù)據(jù),爆發(fā)數(shù)據(jù)和相關流行病學資料，消費者消費方式方面的資料等)，必須達到權威機構如WHO、CAC、美國環(huán)境保護局(EPA)、FDA、經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(OECD)等所認可的最基本數(shù)據(jù)量，其結果才有意義。,JEMRA對即食食品中的單增的風險評估在食品中微生物的數(shù)目從25克無致病菌到每克或每毫升含有1000菌落形成單位(ColonyFormingUnits,CFU)范圍內，評估食品中單增導致疾病的嚴重風險;評估不同易感人群相對于普通群體患嚴重疾病的風險;評估特定食品中單增導致嚴重疾病的風險。theJointFAO/WHOExpertMeetingsonMicrobiologicalRiskAssessment,1.危害識別指識別可能產(chǎn)生健康不良效果并且可能存在于某種或某類食品中的生物、化學和物理因素。對于微生物因素：識別食品中的微生物有機體或微生物毒素及其與人體健康危害的關系。分析類型應包括傳染率(無明顯病狀)、發(fā)病率和死亡率。,危害識別的內容①微生物的基本性狀;②作為危害暴露結果的由微生物所致的食源性疾病的資料;③疾病的易感人群以及傳播方式;④暴發(fā)數(shù)據(jù)和相關流行病學資料;⑤與食品相關的資料：簡要描述何種食品中可存在此微生物，典型危害水平。,RiskassessmentofListeriamonocytogenesinready-to-eatfoods.Website:http://www.fao.org/es/esnAustralianRiskAssessmentmodelforListeriamonocytogenesinready-to-eatmeatshttp://www.foodrisk.org/exclusives/models/AU_listeria.cfm,HazardidentificationIdentifiesknownorpotentialhealtheffectsassociatedwithL.monocytogenesbyestablishingthegeneralrelationshipbetweenthepathogen,itspresenceinfoods,andtheadverseoutcome(illnessordeath)associatedwithconsumptionofcontaminatedfoods.,PopulationGroupsEvaluatedPerinatal:Theperinatalgroupincludesfetusesandneonatesfrom16weeksafterfertilizationto30dayspostpartum.Elderly:Individualswhowere60ormoreyearsofage.Intermediate-agegroup:bothhealthyindividualsandcertainsusceptiblesubpopulationgroups,suchasAIDSpatientsorindividualstakingdrugsthatsuppresstheimmunesystems).在歐盟，55.6%的李斯特菌病患者大于65歲。以前，感染此病的人大多是孕婦，但現(xiàn)在主要是傳染老年人中免疫力低下的人群。在美國，88%患病與懷孕無關，71%的患者年齡大于44歲，40%的患者年齡大于或等于70歲。,危害識別單核細胞增生李斯特氏菌是李斯特氏菌屬7個種中的1個,該菌為G+、兼性厭氧菌,可以在Aw>0.92、pH值4.39～9.4、溫度-0.4～45℃、鹽濃度≤10%的環(huán)境下生長.分布廣泛，人和動物糞便中均可能存在該菌。人和多種動物均可是該菌的健康攜帶者，估計2%～6%的人和動物攜帶有該菌，因此人或動物糞便污染食物后經(jīng)口傳播是該菌的主要傳播途徑。但李斯特菌病的暴發(fā)和散發(fā)病例主要與即食食品有關。李斯特氏病的發(fā)病率為每年每百萬人2～6例，死亡率20%～30%。,危害識別70℃以上的熱處理可以殺滅單增李斯特氏菌。在煮制與包裝工序間可能會發(fā)生二次污染，在較長時間(如≥35d)的貯藏期內，該菌可在產(chǎn)品表面繁殖,數(shù)量增加至產(chǎn)生危害的水平。美國人患李斯特菌病主要是散發(fā)（僅5%的病例與疾病暴發(fā)有關）。人類李斯特菌病散發(fā)及暴發(fā)流行病例均表明污染LM的即食食品與運輸有關。,危害識別據(jù)美國CDC報道，美國每年約有2,500例李斯特菌病例,其中約有20%死亡。1999年，單增引起的致死率在所有食源性致病菌中位居第二位，引起的住院率位居第一位(90%)。在23個歐盟成員國中，2001年有910人患李斯特菌病，2005年1427例，2006年為1583例,是1996年病例數(shù)的2.4倍,發(fā)病率為0.3/100萬,其致死率超過30%，住院率高達91%。澳大利亞:2006年李斯特菌病為59例,發(fā)病率為3/100萬,與2001-2005年的平均發(fā)病率(3.2/100萬)相似。日本：每年的病例數(shù)為83例,發(fā)病率為0.65/100萬,,2.危害描述對與食品中可能存在的生物、化學和物理因素有關的健康不良效果性質的定性或定量評價。對生物或物理因素,如數(shù)據(jù)可得到時，應進行劑量-反應評估。劑量-反應評估的目的是確定某種化學、生物或物理因素的暴露水平(劑量)與相應的健康不良效果的嚴重程度或發(fā)生頻度(反應)之間的關系。Estimatestherelationshipbetweentheexposurelevel(dose)andfrequencyofsevereillnessormortality(response).,危害特征描述的內容致病菌的致病性、毒力、傳染性、抗生素耐藥性;相關食品對致病菌生長、增殖、產(chǎn)毒和感染力的影響;宿主和媒介生物的特性;致病菌造成的疾病和并發(fā)癥，致病菌引起的免疫反應;劑量-反應關系模型(指數(shù)模型、β-泊松模型、韋伯-伽馬模型、蒙特卡羅模型)的構建等。,危害描述WHO李斯特氏病其列為1990’s四大食源性致病菌之一；孕婦、嬰兒、60歲以上老人和免疫低下的人是易感人群；李斯特氏病輕度癥狀表現(xiàn)為流感癥狀，中度表現(xiàn)為胃腸炎、腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)等，嚴重的可致死，死亡率可達20%～30%。,危害描述食源性李斯特氏病的發(fā)生：偶然的孤立事件：如家庭冰箱的二次污染造成。局部發(fā)生：由于加工廠操作不當造成某一批產(chǎn)品殘存單增李斯特氏菌，且該批產(chǎn)品在食用前有機會生長繁殖,消費者食用該產(chǎn)品后得病。大面積發(fā)生：由于加工設備或環(huán)境污染了單增李斯特氏菌，造成該車間或生產(chǎn)線生產(chǎn)的多批產(chǎn)品污染該菌，消費者食用該產(chǎn)品后得病。,劑量反應關系P=1-e-r*N。P表示嚴重疾病(侵染性李斯特菌病)的概率N代表攝入單增的數(shù)量r代表單一細菌導致侵襲性李斯特菌病的概率，是根據(jù)美國2001年暴露模型中的食品污染分布以及CDC對李斯特菌病估計病例數(shù)倒推而得到的。,HumanSusceptibilityImmunologicalandphysiologicalfactorsinhumansplayaroleindeterminingthesusceptibilitythatmaybefoundthroughoutapopulation.Theprobabilityofdeathisdescribedforthethreedifferentage-basedgroupsofpeople.Asindicatedabove,epidemiologicalinformationisusedtoadjustthedose-responsemodeltofitthenumberoflisteriosisfatalitiesobservedinFoodNetandtodevelopthedose-responsemodelforeachofthesegroups.,VirulenceEpidemiologicalinformationandlaboratorystudiesindicatethatdifferentstrainsofL.monocytogenesvaryintheirabilitytocauseillness.Thisvariabilityinfluencesthenumberoforganismsrequiredtoproduceillnessandpossiblytheseverityofsymptomsofillness.Alargenumberofpotentialhumanvirulencefactorshavebeendescribedthatseemtooccurinessentiallyallofthehumanandenvironmentalisolatesthathavebeenstudied.Datafrommouselethalitystudiesareusedtomodeltherangeofstrainvirulencethatmaybeencountered.,3.暴露評估指對于通過食品的可能攝入和其他有關途徑暴露的生物、化學和物理因素的定性或定量評價。微生物因素：對所消費食品中的致病菌的數(shù)量或細菌毒素含量以及有關的膳食信息進行評估,給出食品在食用時致病菌的數(shù)量或細菌毒素含量的估計值。其污染水平是動態(tài)變化的,所以暴露評估應描述從生產(chǎn)到消費的整個過程。預測微生物學是暴露量評估的有用工具。,暴露評估很多種食品都曾導致過零星發(fā)生或大規(guī)模爆發(fā)的食源性李斯特氏病,在這些食品中單增李斯特氏菌的含量約為100～1×109cfu/g;其中即食食品最容易污染。SCVPH在1999年報道動物食品中李斯特菌病發(fā)生率是1%～10%。這與其在2005及2006年的報道一致大量分子分型實驗已證實食品生產(chǎn)廠的環(huán)境是食品污染LM的污染源；溫度是影響食品中LM的重要因素之一,FoodConsumptionFoodContaminationPost-RetailGrowthofListeria--“growthmodule”.考慮消費前致病菌生長繁殖的影響因素,如:貯藏溫度、貯藏時間、在不同食品中的生長速度(采用預測性模型評估在食品中的生長速度、失活速度及生長限制)等;結合食品消費的數(shù)量和頻率,將各種因素擬和到模型中,從而獲得消費時食品中單增的濃度,以log10CFU/份污染食品的累積概率來表示。,,歐盟2005年LM污染率較高的即食食品是肉（2.7%）及魚制品（7.5%），其中魚制品中29%的污染量大于100/g。2006年LM污染最高的即食食品是魚制品（4.9%），其次是牛肉制品（3.5%）和豬肉制品（2.7%）。少量樣品的污染量高于100/g。歐盟委員會2004年和2005年的概要報道中，2%～3%的零售即食蔬菜含有LM，低于1%的樣品中含有高于100cfu/g的LM；0.4%的奶油樣品被LM污染。,4.風險描述根據(jù)危害識別、危害描述和暴露評估，對某一給定人群的已知或潛在健康不良效果的發(fā)生可能性和嚴重程度進行定性或定量的估計，包括與這些評估有關的不確定性的描述。將前面階段的所有信息結合在一起，提供一個給定人群的合理評價。這種評估可以通過將單個與危害有關的流行病學數(shù)據(jù)與疾病的普遍性進行比較而得到。,風險特征描述必須回答:影響健康的風險的本質及發(fā)生的可能性;哪些個體或人群存在上述風險;不良效應或影響的嚴重程度。,,‘What-If’Scenarios假設分析方法RefrigeratorTemperatureScenarioStorageTimesScenarioHomerefrigeratorstemperaturesCasesoflisteriosisThepredictednumberreducednormal210545ºForless65669%notexceed41ºF28>98%StoragetimeCasesoflisteriosisThepredictednumberreduced28days22814days19713.6%10days15432.5%,風險描述綜合了前3個步驟的資料信息，將暴露評估的結果應用于劑量-反應關系模型，最后用不同人群每百萬份食品產(chǎn)生的風險來表示結果，并用每份食品的風險、食品份數(shù)來估計特定群體中每年的病例數(shù)。評估結果顯示，對于消毒牛奶、冰淇淋、發(fā)酵肉類和熏魚，每年每千萬人中李斯特菌病病例數(shù)分別為9.1、0.012、0.46和0.00066。,其他一些重要結果幾乎所有李斯特菌病均因食用了大量病原菌所致。因攝入單增菌致病的概率可以用致病三要素(食品成分、菌種致病力、消費者易感性)來解釋。絕大多數(shù)的李斯特菌病與食用不符合現(xiàn)行食品限量標準的食品有關，而與標準的嚴格程度(0.04CFU/g或100CFU/g)無關。防止食品食用時出現(xiàn)重度污染的控制措施,對降低李斯特菌病發(fā)病率具有極大作用。對于有利于病原菌生長的食物,更嚴格地控制溫度或限制貯存時間等控制措施,將會減輕因單核細胞增生李斯特菌數(shù)量的增加而導致的風險的增加。,QuantitativeMicrobialRiskAssessmentforStaphylococcusaureusandStaphylococcusEnterotoxinAinRawMilkJournalofFoodProtection,72(8)2009,1641–1653,國內的相關研究對牡蠣副溶血弧菌的風險評估對帶殼雞蛋中的沙門菌的定量風險評估對進境凍大馬哈魚溶藻弧菌的風險評估等,存在問題數(shù)據(jù)不連續(xù)數(shù)據(jù)覆蓋的地區(qū)少等