大學(xué)實(shí)驗(yàn)-工業(yè)微生物的篩選和紫外誘變育種一．實(shí)驗(yàn)?zāi)康模杭由顚Πl(fā)酵工程上游技術(shù)中菌種選育的認(rèn)識(shí)；學(xué)會(huì)常規(guī)選種和育種的方法，樹立科學(xué)認(rèn)真仔細(xì)的態(tài)度，培養(yǎng)科研協(xié)作精神。二、實(shí)驗(yàn)原理：根據(jù)一定的生產(chǎn)目的如抗生素或酶類的生產(chǎn)，建立不同的篩選模型，并從特定的樣品如土壤中篩選出高產(chǎn)適宜的菌株。三．培養(yǎng)基及儀器：降解亞硝酸鹽培養(yǎng)基：NaNO20.2%，KH2PO40.7%，MnSO4.H2O0.25%，Na2HPO41.35%，MgSO4.7H2O0.1%，葡萄糖1％，瓊脂2％，0.1MPa滅菌20分鐘。6個(gè)250ml三角瓶，各裝100ml培養(yǎng)基。同時(shí)滅菌試管20支，1ml吸管12支，普通平皿60個(gè)，滅菌生理鹽水。培養(yǎng)亞硝酸鹽降解菌發(fā)酵液1瓶，每位同學(xué)準(zhǔn)備1個(gè)斜面。3．潔凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、三角瓶、曲玻棒、平皿。四．操作方法課前半小時(shí)打開超凈工作臺(tái)滅菌。1.土壤中降解亞硝酸鹽細(xì)菌的篩選分離稀釋土樣。5g土樣，加入45ml無菌水中。為10-1，然后取1ml加入9ml無菌水，為稀釋10-2，直至稀釋至10-8溶化培養(yǎng)基。將溶化后不燙手的培養(yǎng)基倒入平皿，剛好蓋過平皿底部，迅速搖勻后放置，使培養(yǎng)基冷卻，要求平皿培養(yǎng)基表面平整、光滑。吸取10-4，10-5或10-6相應(yīng)濃度的土樣稀釋液0.5ml，加入平皿內(nèi)，用燒過滅菌的曲玻棒均勻涂平，放入37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48小時(shí)。 2.亞硝酸鹽分解菌的紫外誘變育種取10ml培養(yǎng)好的液體培養(yǎng)液，放入90mm培養(yǎng)皿，將皿放置于誘變箱的磁力攪拌器上,置于30W紫外燈下，照射90s，用無菌生理鹽水稀釋至10-6，10-7，10-8，按常規(guī)方法涂布篩選平板。同學(xué)可自行選擇培養(yǎng)亞硝酸鹽降解菌和誘變菌。每位同學(xué)做一個(gè)平皿。并標(biāo)記好稀釋度、種類和名字。五、實(shí)驗(yàn)進(jìn)程安排及結(jié)果分析（1）第1次實(shí)驗(yàn)：稀釋土樣，倒平板，冷卻后進(jìn)行平板涂布，放入恒溫培養(yǎng)箱中；或進(jìn)行菌種誘變，稀釋誘變菌，倒平板，冷卻后進(jìn)行平板涂布，放入恒溫培養(yǎng)箱中。然后緊接著進(jìn)行第二個(gè)實(shí)驗(yàn)。（2）第二次實(shí)驗(yàn)：同學(xué)回到實(shí)驗(yàn)室中，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。培養(yǎng)24-48h后，記錄觀察到的菌落數(shù)量。并對其中2-5個(gè)不同菌落進(jìn)行形態(tài)描述。挑取其中1個(gè)菌落，接入斜面培養(yǎng)基進(jìn)行菌種保藏。 實(shí)驗(yàn)二雅致放射毛霉發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)基確定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆瘴⑸镄迸囵B(yǎng)基確定方法，學(xué)會(huì)對已確定菌種確定實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵工藝。二、實(shí)驗(yàn)原理：篩選微生物最適生長及產(chǎn)物形成的營養(yǎng)條件和培養(yǎng)條件，以確定特定產(chǎn)物發(fā)酵的工藝參數(shù)。三、儀器及試劑：蔗糖，酵母膏，MgSO4等高壓滅菌鍋、潔凈工作臺(tái)、恒溫振蕩培養(yǎng)箱。四、操作方法：1、種子培養(yǎng)基2、產(chǎn)酶培養(yǎng)基確定2.1培養(yǎng)基的配制，各組分別選擇以下六種培養(yǎng)基配方：（1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基：（100ml）豆粕粉3g，蔗糖0.8g，酵母膏0.1g，MgSO40.36g，KH2PO40.12g，CaCl20.1g。（第一組）（2）第二組，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中蔗糖按成等例葡萄糖；（3）第三組，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中蔗糖按成等例馬鈴薯淀粉；（4）第四組，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中去掉酵母膏；（5）第五組，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中去掉豆粕粉，并將酵母膏添加量增至0.5％。（6）第六組，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中去掉MgSO4和CaCl2。2.2培養(yǎng)基滅菌高壓滅菌鍋，121℃，20min滅菌。冷卻至室溫，將上述物品并洗耳球轉(zhuǎn)入超凈臺(tái)，接種前20min進(jìn)行紫外空氣滅菌。 2.3接種冷卻到室溫開始接種，接種量10％，然后在在28℃、250r/m的條件下培養(yǎng)至發(fā)酵液顏色變深、澄清為止。2.4酶活力測定根據(jù)各組測定酶活結(jié)果，比較確定適宜培養(yǎng)基組成。（1）定義：1g固體酶粉，在一定溫度和pH值條件下，1min水解酪素產(chǎn)生1ug酪氨酸為一個(gè)酶活單位，以u/g表示。（2）原理：蛋白酶在一定溫度與pH條件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸終止酶反應(yīng)，并使未水解的酪素沉淀除去，濾液對紫外光有吸收，可用紫外分光光度法測定。根據(jù)吸光度計(jì)算其酶活力。（3）試劑和溶液①三氯乙酸（CCl3.COOH）=0.4mol/L：稱取三氯乙酸32.7g，用水溶解并定容至500mL②磷酸緩沖溶液③100ug/mLL—酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液④10g/L酪素溶液⑤待測酶液：取1ml發(fā)酵液稀釋備用。（4）分析步驟①求K值②測定a.先將酪素溶液放入（40±0.2）攝氏度恒溫水域中，預(yù)熱5min；b.按下列程序操作：試管A（空白）（第二試管）試管B（酶試樣，作三個(gè)平行樣）（第 三試管）↓↓加酶液2.00mL（移液管2ml）加酶液2.00mL↓（40±0.2℃），2min↓（40±0.2℃），2min加三氯乙酸4.00mL（搖勻）（移液管5ml）加酪素2.00mL（搖勻）↓（40±0.2℃），10min↓（40±0.2℃），10min加酪素2.00mL（搖勻）（移液管2ml）加三氯乙酸4.00mL（搖勻）↓↓取出靜止10min，過濾（第四試管，小漏斗）取出靜止10min，過濾↓↓在275nm波長下，用10mm在275nm波長下，用10mm比色皿測其吸光度比色皿測其吸光度（5）計(jì)算（=135）X=A×K×8/2×1/10×n×E=2/5×A×K×n×E式中X——樣品的酶活力（u/g）A——試樣溶液的平均吸光度K——吸光常數(shù)（K=135）8——反應(yīng)試劑的總體積（mL）2——吸取酶液2.00mL，以1mL計(jì)1/10——反應(yīng)時(shí)間10min，以1min計(jì)n——稀釋倍數(shù)E——紫外法與福林法的換算系數(shù)（取0.50）五、實(shí)驗(yàn)進(jìn)程安排及結(jié)果分析 （1）第1次實(shí)驗(yàn)：配制培養(yǎng)基，滅菌，等待滅菌時(shí)進(jìn)行發(fā)酵罐的上罐觀察。（2）第2次實(shí)驗(yàn)：下?lián)u瓶，測定發(fā)酵液中蛋白酶活力，對比各組實(shí)驗(yàn)，確定培養(yǎng)基；或從發(fā)酵罐上取樣，測定發(fā)酵液中蛋白酶活力。 實(shí)驗(yàn)三雅致放射毛霉5L發(fā)酵罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆瞻l(fā)酵罐的操作技能，學(xué)習(xí)微生物在發(fā)酵罐上發(fā)酵的過程和實(shí)驗(yàn)方法。二、儀器分光光度計(jì)、電熱恒溫水浴鍋、生物發(fā)酵智能控制系統(tǒng)。三、試劑1、DNS試劑：取6.3g3,5-二硝基水楊酸（DNS）和262mL2mol/LNaOH溶液加到酒石酸鉀鈉的熱溶液中（192g酒石酸鉀鈉溶于500mL水中），再加5g重蒸酚和5g亞硫酸鈉，攪拌使其溶解，冷卻后加水定容至1000mL，保存于棕色瓶中放置7天后使用。2、10g/L酪素溶液3、種子培養(yǎng)基4、產(chǎn)酶培養(yǎng)基四、實(shí)驗(yàn)方法1、學(xué)習(xí)發(fā)酵罐的使用方法。2、發(fā)酵罐中加入培養(yǎng)基，滅菌。3、接種、培養(yǎng)。4、測定酶活:a.先將酪素溶液放入（40±0.2）攝氏度恒溫水域中，預(yù)熱5min；b.按下列程序操作：試管A（空白）（第二試管）試管B（酶試樣，作三個(gè)平行樣）（第 三試管）↓↓加酶液2.00mL（移液管2ml）加酶液2.00mL↓（40±0.2℃），2min↓（40±0.2℃），2min加三氯乙酸4.00mL（搖勻）（移液管5ml）加酪素2.00mL（搖勻）↓（40±0.2℃），10min↓（40±0.2℃），10min加酪素2.00mL（搖勻）（移液管2ml）加三氯乙酸4.00mL（搖勻）↓↓取出靜止10min，過濾（第四試管，小漏斗）取出靜止10min，過濾↓↓在275nm波長下，用10mm在275nm波長下，用10mm比色皿測其吸光度比色皿測其吸光度（5）計(jì)算（=135）X=A×K×8/2×1/10×n×E=2/5×A×K×n×E式中X——樣品的酶活力（u/g）A——試樣溶液的平均吸光度K——吸光常數(shù)（K=135）8——反應(yīng)試劑的總體積（mL）2——吸取酶液2.00mL，以1mL計(jì)1/10——反應(yīng)時(shí)間10min，以1min計(jì)n——稀釋倍數(shù)E——紫外法與福林法的換算系數(shù)（取0.50）五、實(shí)驗(yàn)進(jìn)程安排及結(jié)果分析 （1）第1次實(shí)驗(yàn)：在實(shí)驗(yàn)老師準(zhǔn)備的已滅菌培養(yǎng)基和罐體的前提下，觀察罐上接種。同時(shí)熟悉罐的結(jié)構(gòu)及每一部件用途。（2）第2次實(shí)驗(yàn)：在下?lián)u瓶測定發(fā)酵液中蛋白酶活力的同時(shí)，每位同學(xué)在發(fā)酵罐上取樣，測定發(fā)酵液中蛋白酶活力。